光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软， XeF[ mT
切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。 hpjt
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石蜡作为包埋剂，有其独特的优点，例如：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。然而石蜡切片的制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃，而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大，这些不足之处必须在制片过程中认真对待，尽量减小它的不良影响。 GqH2Y@mg
石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。 ‑e r$7T'
1．取材 zFFFIc [
材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。 B;OgFK2Mbe
（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。 4H Z8@f%
（2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。 xW-2ROgV
（3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 OO@ 9#
（4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。 0
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2．固定 *F}zcu
组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。 hXLZLd<R+
固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。 /e)Q"lg'
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。 G4~6],2G#
简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。 FNB )5
简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有： zq]]!?S
Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。 19 wa:B2KR(b
固定时，须注意以下几点： ID/`Zg
（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。 +Qs x‑5'C
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。 2|NniLvM
（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。 (!z_
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（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。 3q6^= 2s
（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。 j,E@Ot#p;
（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
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3．脱水 d:> M
生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。 p9iO ^gJ
脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。 D6M, 8XXd
常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。 c)~36& W
丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。 c~$J
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甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。 T^Xqi1 c
二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。 fz=DK@gz
正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。 PiUR,Awv
叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。 ilwz7?GWS-
4．透明
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组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。 + F5^D:5X
透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。 ?9|AS6?7
二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 20 m|ft,7a+z
甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。 wlVBmC0F
苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明。 [7TaG )G
5．透蜡和包埋 ZX5Wx(Zkp&
包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。 &+rd1QX#,
石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。 v,a#=DDT
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。 nmx,`!
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透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。 }vJB`Sd/v
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
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包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。 '@[ad
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6．切片 *u&]
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（1）石蜡块的固着与整修 ,2-
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在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 -`
6*`dwjA
固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。 'U+]a4=
整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。 5X?ASjL)
（2）切片机和切片刀 wzCR Xz
切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。 n
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切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。 G
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（3）切片方法 JnAG~TG~
切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。 `n.8DvNG
（4）切片中存在的问题及补救方法 LP
H-s2sN
石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法列于表1-3。 |w‑?JS$th
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2!m
表1-3 石蜡切片可能产生的问题和解决方法 ]]B ‑wl{
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缺 点：石蜡带弯曲不直 KB43
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原 因： 8kXt4gk y
1．石蜡块上下两边不平行 0o$5}GK
2．石蜡块的上下两边不和刀口平行 2
8/ vNv
3．刀口锋利不一，局部产生差异 d9Jm`<*n_
4．蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致 ScaK?4m/
5．材料未居蜡块正中央 F"t oUZ%p
6．材料大而形不正 Y-c:V3CO V
补 救 办 法 ： A~7 ; :s\
1．取下台木，将两边修干 &6$BqdE
2．调节标本台，使两者平行 |(W@07e@
3．移动刀片，改用新的刀口 -v (,Yy
4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋 AM'"-i} `
5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中 l+_ $2
6．在大的一边切去少许石蜡 "YM9)‑f1a
- m@?dmiQt
缺 点：切片分离、不能连成带状 Ceo7tE.f@
原 因： `*OIh9
1．室温过低 W.&
El"R
2．石蜡过硬 _i/WksmX
3．材料边缘留蜡太少 3E1g4p8G
4．刀的角度不适合
'W9'vb8
补 救 办 法 ： lO
TUQ h
1．在切片机上方开一电灯或提高室温 5QcJ9=A
2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面 ‑Z -33F
3．重新包埋 G_cw\M
4．矫正刀的角度 El6v y
x 9u=)g
缺 点：切片卷起呈圆筒状 .) =cy
原 因： 68q7K7lQ
1．室温过低 [OU~2 d3
2．石蜡过硬 cwXP#A7
3．刀口太钝 )Z NJId\]
4．刀的倾角太大 4 *N4)ho
补 救 办 法 ： |}M4 cL+
1．提高室温 y$ze}A
2．加软蜡 PQE('1}
3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成带 %G9y|kkg$
4．减小倾角 (jW@EV}Y
[oA3k‑$t
缺 点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起 p}wrcz
原 因： k$y);yBY
1．室温过高 T%R5t8zZ"_
2．石蜡过软 ^
3\-FLE
3．刀口上留有一层石蜡 Lped8'Am>
4．刀口钝 GeN_3%&&
补 救 办 法 ： Le
MfJm$-0
1．降低室温 W
^|PvzU
2．将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加 1v),P 1
3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡 or Y
k$e2'
4．磨刀或移动刀口 v,/3LAs+L/
3
‑fi
缺 点：切片纵裂 H O\hKaW,
原 因： oG
<Gi{@
d
1．刀有缺口 9Ct .l
2．石蜡块中含有颗粒、杂质 e FnIbP
3．刀口留有碎屑或细丝 e17LXch9.
4．组织太硬 p9Z2w+R‑
补 救 办 法 ： MuWzs1H%%Y
1．可移动刀口 v (^ ] z
2．将颗粒拽去 Ph3K‑ib
3．清洁刀口 C%'qtnX
4．让包埋块在水中浸泡 e!xZ3
^IL
G9
q
;
缺 点：切片有横纹 VSwV|r0pt
原 因： v/v
zTnN:
1．刀和台木的固定螺丝太松 A'TqdC&cH
2．刀口倾斜度太大
)Qx8 ;\
3．刀口有石蜡屑 kt2 M1!NM
补 救 办 法 ： ?5w>W
1．旋紧螺旋 :K>B/6zr
2．可放平1—2。后再切 E&U/B.ng
3．用氯仿拭去 h0X94i 9
nH5bs*
缺 点：切片厚薄不匀 3n'‑C
J F
原 因： [(tg.#}7t
1．切片机有毛病 b}#vlK
2．夹刀不当 ‑33UQ|*
3，未旋紧标本台螺旋 [ kGB}
4。石蜡块过硬
h~h u
补 救 办 法 ： XCSfpW
1．矫正切片机装置
sXt"mOU
2．对症治疗 R^"syaK
3．旋紧螺旋 r`0Nk 3JY+
4．将石蜡块在水中浸泡 r&k\2>)
2s<|
vta-
缺 点：每张切片厚薄不匀 S(&R4p@
原 因： a>7N~L'.G
1．刀口震动，是由于材料过硬 "e`mv
2．刀的倾角太大 $d+Ll q6E
补 救 办 法 ： +K;*{m ]
1。在蜡块表面涂一层火棉胶 \A QJ6F
2．减小倾角 @h'/^q'Bz>
RkV#V,?[M
缺 点：材料发生裂隙破碎或脱落 Qell~ v,Z
原 因： Vo
y_qAAv
1．脱水不干净 ak` nwIu#n
2．有透明剂残留 unP?
3．石蜡透入时，温度过高或时间过长 :~$P8](4m
4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆 FzPfBDX`,
5．材料太硬或太粗 r6=uUXf!z
补 救 办 法 ： VJ-{o}C?A
1．无法弥补 q
4we$D(
2．增加浸蜡时间，重新包埋 -+?XU#%,Q`
3．无法补救 6U $Rgs0
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明 k|$IWY
5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液 F 5-_/^2i
]`1va%B
缺 点：切片时发生沙沙声 IM{g 5R
原 因： %d*H"_+]
1．组织块过硬 ^A'$|42
2．包埋温度过高 D%(A=}X6x
3，材料内留有结晶体 f7fE* 1zR
补 救 办 法 ： #>,C=>qR
1．浸泡水中软化 &I{!t &c
2．无法补救 Wr\A?$u V
3．无法补救 _rdu@hi^
@%7!
44 Fx
缺 点：石蜡块将蜡带抬起 US@e-J
原 因： wJb2'dXL
1．由于摩擦而产生静电荷所致 4Rz
B
r
2．石蜡块上面附有石蜡碎屑 l{Zoz‑{P3
3．刀口上附有石蜡碎屑 `A+p ,,
补 救 办 法 ： {G3|[\yd9
1．提高室温 O
A, d K
2．用刀片将碎屑清除 OQW=
3．用二甲苯或氧仿清除 RQf[r
:U
FoJ*r
7．贴片 pt9<7c]2i(
切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。 ` .T}kf02
贴片一般有捞片法和烫板法。 % = nR W2]
捞片法比较简单，首先将切片分割开，投入到48℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。 .3LPUOb
烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。 K?Az\8 -?
要注意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。 d_\‑
%O
8．染色 4<>_ 3
组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。染色方法很多，但是染色剂往往是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透明的逆过程。由于切片十分菲薄，处理的时间大大减少，一般每级停留约2～5min。 ]O?$.~uVo
染色是一个复杂的过程，兼有物理和化学作用，对其中的机制目前了解得不很清楚。研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应，显示RNA的Brachet反应，显示多糖的PAS反应，显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等，可以根据不同的要求来选用。 [
5;k]"B
9．透明 -V".E]&`P
染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。 d~8]|B
10．封藏 :Z6hw1yAw
封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。 t$<
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封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。 SS].~J>t
贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。
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置顶卡
变色卡
千斤顶
显身卡
