[重新更新]2014年诺贝尔化学奖-超分辨率荧光显微技术

今年的诺贝尔化学奖相当重要，楼主作为生物领域的一员，前些日子还在苦恼如何在最普通的激光共聚焦显微镜上获得最大的分辨率。在探寻方法的过程中，就有预感这项技术可能会获奖。


声明：以下全文转载Lily BBS，版权归原作者所有


今年的诺贝尔化学奖给了“超高分辨荧光显微技术”，其实如果是干这一行的都知道这是
迟早的事情。中国人总是念叨着谢晓亮和庄小威很遗憾没有拿到这个奖，其中原因我觉得
也没有必要过分猜测，毕竟有些事情是需要一些运气的，他们不是第一个也不会是最后一
个和诺奖擦肩而过的科学家。

言归正传，这个技术到底为什么这么牛，这么重要，事情的起因还要回到1873年。这一年
德国的科学家恩斯特·阿贝（就是阿贝折光仪的发明人）发现了可见光的衍射极限，就是
这个刻在他墓碑上，被广为后人所知的著名公式：

                               
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这个公式里，阿贝明确指出，可见光的理论分辨率和光的波长成反比，和光学器件的数值
孔径成正比。换言之，由于光波的衍射作用，人们是不可能把一束光聚焦到一个无限小的
点上的。这个现在高中生都知道的定理成为日后人们突破衍射极限的动力，尽管在当时看
来，对于微观世界了解的需求还不需要如此高的分辨率。另外说一句，阿贝此人后来投身
光学工业界，也成为了一个企业家，和卡尔蔡司一起创立了久负盛名的蔡司公司。

                               
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现在问题来了，不是关于挖掘机，是关于显微镜：难道对于小于衍射极限的微观世界，人
们就真的一筹莫展了吗？当时看来是这样，直到德布罗依在1924年发现了著名的“物质波
”。后面的故事大家应该都知道了，德布罗依1924年发表博士论文，1929年拿到诺贝尔物
理奖，这个记录至今没有人打破。我估计以现在这种博士毕业做几轮博后的大趋势，广大
千老们也就是远远的瞻仰一下就可以了。话说回来，“物质波”的提出告诉世人：不仅一
个电子一个原子有波动性，一花一叶和世间所有在运动的物体都有波动性！这是个了不起
的发现，很快就有人提出，如果不用光波观察物体，换成物质波，因为其极小的物质波长
，衍射极限就能降到原子尺寸的级别，这对于显微镜技术必然是一个极大的提高。在当时
人们熟知的微观粒子世界，其实选项并不多：质子和氦核的质量都很大，虽然他们的物质
波长都极其短，但把它们加速到一个能用于成像的速度需要极大的能量，显然是不合适的
；中子就更不用提了，傻傻呆呆的还不带电不带磁性，直到现在人类都没有掌握有效操控
中子的方法（用一堆石墨和重水只能减速而已）。这样一来，就剩下一种东西了：电子。
电子这种粒子质量小，来源广泛，可以用电场加速，可以用磁场控制，穿过物体的时候又
不会对物体本身产生很大的破坏（其实做过电镜的人还是会发现电子束有时会产生热效应
和电离效应的），实在是物质波显微技术独一无二的光源。当然，这只是理论，德国人又
花了几年时间，终于在1931年，恩斯特·鲁斯卡研制出了第一台电子显微镜，一方面证明
了物质波理论的正确性，另一方面重新开启了人类对于探索微观世界的大门（55年之后的
1986年，恩斯特·鲁斯卡凭借电子显微镜的发明，拿到了诺贝尔物理奖，我估计这个记录
也很难有人打破，足见活得长有多重要）。故事到这里可以结束了吗？好象是：传统的光
学显微镜解决不了的问题交给电子显微镜解决，似乎一切都顺利成章。



但事情偏偏就不是这样。随着分子生物技术在20世纪下半叶的迅猛发展，人们迅速发现摆
在人类面前的是一个崭新的时代，很多人发出了这样的感慨：“二十一世纪是生命科学的
世纪！”（你问我支持不支持，我说支持，现在都在搞生物我怎么能不支持人类研究生物
呢。但是你一定要问我，学生物有没有前途，我只能回答你：无可奉告！你不高兴我又怎
么办）。当人们把研究的对象从一只只小白鼠转向一个细胞，一个蛋白甚至一个DNA分子的
时候，电子显微镜的弊端显现出来了：高真空。大家都知道，电子在空气里是很难存在的
，随便一个氮分子或者氧分子都可以瞬间让电子灰飞烟灭。所以，无论是透射电镜还是扫
描电镜，样品都必须暴露在高真空环境下。对于一般的透射电镜，理想的条件是要低于10
-7Pa，也就是十万亿分之一的大气压，这是个什么概念，我想了好久，这么说吧，这个比
例比地球和月亮之间的距离和头发丝直径的比例还要多出一个数量级。无论怎样，这么高
的真空，液态水是不可能有的，而且结构上绝大多数生物材料是难以耐受的，更不用提活
体细胞本身了。除此之外，电镜在研究细胞结构时还有对比度的问题，电子束热效应的问
题，总之，就是和人们想要的结果差的很远，怎么办呢？当然，如果只是用电镜拍拍这样
的照片的话，还是很有娱乐效果的。

                               
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主角登场了：超高分辨光学显微技术。

应该说，从电子显微镜再次回到光学显微镜，起初是一次向传统技术的妥协：既然研究分
子生物学必须要在和生物体类似甚至相同的条件下进行，那么就只能回归到传统的光学显
微镜。毕竟，大家都知道，蛋白质，DNA这样的分子只有在适当的条件下才能正常地发挥作
用（不过话又说回来，这次得奖的诸位最初实现这个技术的时候，也都是在低温下做的实
验）。既然存在衍射极限，直接观测显然行不通，那怎么办呢。在突破衍射极限的早期工
作中，有些所谓“远场光学技术”，把这个极限变成了原来的一半。其中，比较有意思的
是这个：

                               
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利用莫列波纹，将栅栏状的光条纹重叠，产生衍射图像，再利用数学的方法把衍射图像还
原成真实的图像。莫列波纹其实是一种比较常见的光学现象，只要把周期性的条状图案重
叠就可以观察到。但是这种称之为Structured Illumination Microscopy（我找了半天没
有找到中文翻译，姑且翻页成“结构照明显微镜”把）的方法需要繁琐的数学转换，实用
性并不非常高。

后来，1992年，Eric Betzig一改远场光学的思路，设计出了“近场光学扫描显微镜”，第
一次得到了观察到了单个分子的荧光信号（说实话，其实Near-Field Scanning Optical
Microscopy现在用的并不多，Betzig今年能拿奖我觉得主要原因是他第一个通过光学显微
镜捕捉到了单个分子的荧光信号，更重要的是他后来的PALM；而Stefan Hell的STED其实现
在用的也不多，因为比较麻烦，但是确实第一次实现了超高光学分辨率）。具体的说，NS
OM的原理和之前的原子力显微镜（AFM）有些类似，都是用很小的悬臂探头探测样品的表面
。不过NSOM是光学显微镜，利用探头表面的消逝场光源作为激发光，然后再用同一个探头
收集发射光的信号。缺点也显而易见，由于需要不断的扫描样品，成像的速度很慢，而且
信号噪音也不小。

                               
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与此同时，远在德国的科学家Hell发明了一种名为“受激发射损耗显微镜”的技术，也就
是STED（Stimulated Emission Depletion microscopy）。STED的原理图如下，解释起来
比较麻烦，牵涉到激光的非线性抑制机制。我在这里只能大概打个比方：很多人都用过BO
SE的降噪耳机，降噪耳机的原理是耳机主动发出一种和外界声波频率、波幅相同但相位相
反的声波，从而抵消外界的噪音，这种抵消的效果当外界的噪音具有周期性的时候是最好
的。STED也是主动发射一束环形的“抑制激光”，把本来存在在四周的荧光信号强行拉回
到基态，但不产生光子。这样一来，本来一个很大的光斑就剩下中心区域一个50-60nm的光
斑，已经大大突破了衍射极限。当然，不是所有激光都有这种“抑制”作用，“抑制激光
”的相位必须和激发激光差180度，才能抑制住周围的光。说白了就是先把整个荧光团激发
起来，再把周围的一圈荧光摁下去，就得到了中心的荧光。这种方法听起来狂拽酷炫，但
是操作起来你懂的，相当繁琐，而且一次只能看一块很小很小的区域，效率实在低。和现
在经常用的PALM或者STORM比起来，差的不是一点。不过正是由于技术上的突破，Stefan
Hell第一次实现了超高分辨的光学显微技术，这次拿诺贝尔奖也是名至实归。

                               
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现在轮到第三位出场了，斯坦福的William Moerner。应该说，Moerner是单分子光谱领域
的创始人（此人是康奈尔物理系的PHD，其实之前的Betzig也是康奈尔物理系的PHD），无
论是时间上还是研究深度上。为什么这么说呢，首先他老人家早1989年就利用吸收光谱在
4K温度条件下观察到了单个并五苯（就是五个苯环并在一起一字排开的那种分子）的荧光
信号，这本身就是一个革命性的成果：第一是观测到来自单个荧光分子的信号，第二是用
的吸收光谱而不是发射光谱。尽管那个时候还没有现在这么先进的光学成像技术，人们还
“看不到”单个分子，但来自单分子的光谱信号本身就是里程碑式的。后来的M. Orrit ,
R.A. Keller, R. Rigler包括谢晓亮的实验，应该多多少少受了Moerner的启发。现在人
们广义上讨论的单分子技术，其实包括了Single-molecule spectroscopy 和Single-
molecule microscopy两个部分。如果说Moerner早期的实验开创了Single-molecule
spectroscopy的先河的话，1997年Moerner利用激光再次“活化”荧光蛋白的实验则是把
Single-molecule microscopy的研究推向了一个前所未有的高度。这一次，Moerner和钱永
健的合作成就了后者后来在荧光蛋白领域的领先地位，当然，钱永健也在2008年拿到了诺
贝尔化学奖（这里给大家一个链接供大家膜拜一下
http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6640/abs/388355a0.html
一篇1997年Nature的两个作者都分别得了诺贝
尔奖）。如果说今年的诺贝尔奖三个人要排个重要性，我觉得Moerner作为单分子技术的创
始人应该是当之无愧的第一。

                               
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最后给一张时间轴

                               
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技术上的问题我就说到这里，我想再回到文章的开头说说谢晓亮和庄小威。有人开玩笑说
今天晚上他们会在哈佛外的酒吧喝一杯，互相安慰一下和诺贝尔奖失之交臂。其实吧，我
个人觉得，科学家不是为了诺贝尔奖而活的，之所以选择走这条路很大程度上是因为能从
研究中得到异常的成就感和喜悦感。或者就是一个字----爽。单分子领域的人才就像是天
上的星星，总会在群星中不经意地蹦出来，这种感觉，和做单分子实验是一样一样的：屏
幕上一片黑暗，但是在黑暗中总有一些亮点在闪，那种美妙闪光带来的喜悦和期望，也许
是外人永远无法理解的。

哦，涨知识了。看似不可突破的光学极限，就用这种方式突破了。

有木有图？

不愧是诺贝尔理综奖……又是这种跨界产品

表示非常的强大

liaoxin400 发表于 2014-10-9 14:14
有木有图？

图来了