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崩溃了，折腾一个月的实验濒临失败……

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活动星图 发表于 2008-5-5 22:04 | 显示全部楼层 |阅读模式 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP

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下午做基因扩增，到后边的凝胶电泳检测，一直很顺利，貌似没出错的说，结果紫外灯下胶板没显示出有亮带（EB染色，EB是一种能和DNA结合的染色剂，在紫外线下可发出荧光），我们还以为是染色剂加少了，又把胶板放到大培养皿里，加50微升EB+200毫升双蒸水（原来是20微升 EB）的染色剂里染色10min，结果还没东西，郁闷死了。后来在收拾东西准备撤的时候想起查看实验原始纪录，不看不知道一看吓一跳，设置PCR程序的同学把DNA变性时间设到3分钟！！！是正确值的6倍！！！这样做下去DNA肯定都“死”了！幸好上次提的pUC19质粒（需要扩增的原始DNA）还剩下点没用的，明天还能补救一下。  这事气得我一天没吃饭，饿死了
失败, 实验, 折腾, 濒临

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购买望远镜就在牧夫天文商城
shy 发表于 2008-5-5 23:19 | 显示全部楼层 来自： 中国–江苏–南京 鹏博士宽带
失败是成功他妈　
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-6 06:59 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
这他妈也太不友善了。。。
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gaorj 发表于 2008-5-6 07:41 | 显示全部楼层 来自： 中国–吉林–长春 联通/吉林大学
这个，程序都设好存在机器里啊，怎能搞错？难道你用的是古董级的PCR，每次都要重设？新手做实验还真不放心，反复叮咛也不好使，直到自己碰壁。心疼钱啊。但许多人都这么过来的，你又有什么办法啊。这种质粒我们也有的。
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-6 12:52 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
原帖由 gaorj 于 2008-5-6 07:41 AM 发表

                               
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这个，程序都设好存在机器里啊，怎能搞错？难道你用的是古董级的PCR，每次都要重设？新手做实验还真不放心，反复叮咛也不好使，直到自己碰壁。心疼钱啊。但许多人都这么过来的，你又有什么办法啊。这种质粒我们也有的。 ...

开学初给一些喜欢分子实验的同学来练习PCR的操作，昨天就用他们设的程序，昨天老师也没有仔细检查就开始做了，结果过了快10个循环时才发现问题。后来开了个小会，最高等级的主任要我们设置两台好用的程序的PCR放在某角落，以后有大实验就用这两台，而且专人操作。。。你们的质粒是自己提的还是买的？
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-6 22:30 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
我活着回来了。。。。快虚脱了，今天扩增出来很多，但是胶板太多（为了保险起见，跑了30个胶板-_-!），切胶都花了一个小时，明天还要去溶胶回收质粒，做到9点半，晚饭午饭都没吃，用仅剩的一点力气跑到食堂却看见师傅们挂出打烊的牌子。。。。其实力气早没了，后来主任不知从哪个抽屉里找到仨鸡蛋，就在水浴锅里煮了……
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江涛 发表于 2008-5-6 22:51 | 显示全部楼层 来自： 中国–江苏–扬州 电信
变性时间怎么要30s？多少kb的片段
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-7 07:17 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
pUC19能有多大，试剂盒上写的就是变性退火各30s，延伸1min
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gaorj 发表于 2008-5-7 08:38 | 显示全部楼层 来自： 中国–吉林–长春 联通/吉林大学
奇怪，你做全质粒PCR? 一般蛋白质的基因长度也2k以内啊，试剂盒上的条件不一定能拿来就用的，它是标准反应，得根据你的目标是多长，酌情修改，你看看试剂盒中目的基因的长度和你的差多少，你的目的基因大于1kbp就得修。改。质粒的来源包括交换和购买
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-7 12:49 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
这些质粒都是刚从E.coli里提的，可不是只用质粒么

对了，LS是怎么处理EB染过的胶板的？

[ 本帖最后由 活动星图 于 2008-5-7 13:23 编辑 ]
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cyz1972 发表于 2008-5-7 13:05 | 显示全部楼层 来自： 中国–广东–广州 广州恒汇网络通信有限公司
听起来好神奇哦！。。 都是科学家！
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gaorj 发表于 2008-5-7 14:48 | 显示全部楼层 来自： 中国–吉林–长春 联通/吉林大学
看来你的实验目的是从质粒里钓基因吧？胶回收我们都用试剂盒，有小柱子和 微乳两种，回收效率都可以。需要更多的答案你还是到丁香园泡泡吧www.dxy.cn。puc19的大小为2686bp, 想做基因表达你就需要更多信息http://www.genecool.com/bbs/redi ... 4&goto=lastpost。
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-7 16:48 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
啊！你也上基因酷啊！

我的胶板拿浓硫酸泡半天，然后喂火炉了。。。锅炉房的

[ 本帖最后由 活动星图 于 2008-5-7 16:50 编辑 ]
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gaorj 发表于 2008-5-7 18:03 | 显示全部楼层 来自： 中国–吉林–长春 联通/吉林大学
你说是后处理，我们有回收的地方。处理有害垃圾。
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 楼主| 活动星图 发表于 2008-5-7 18:19 | 显示全部楼层 来自： 中国–北京–北京 鹏博士BGP
是啊，我这没人管回收，除了EB，还有升汞让人头疼呢
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