一丈法师的提示很重要，今天学习了一下清楚了许多问题，以下为转载《科勒照明的正确调整》
为使显微镜检方法如：明视野、相差、微分干涉相衬、偏光相衬或偏光之下能获得尽可能最好的成像，至关重要的一项工作便是要把显微镜的照明光路系统作出正确的调整.
应该认识到, 在显微镜检工作中样品的照明是极为重要的一项参数, 也是显微照相工作中要求严格的参数. 回顾一下，1893年德国蔡司的库勒先生(August Kohler) 首先研发了一种完善的照明方法, 而成为一种能对样品提供最佳照明的方法. 随后, 由于这一方法能使样品获得均匀而又充份明亮的照明, 而且又不会产生耀眼的眩光, 因此, 近代的实验室用显微镜制造厂都纷纷推荐使用这一方法, 从而使得显微镜的使用人员可以发掘出显微镜的所有潜在能力.
所以, 显微镜的正确调试, 主要的工作就是照明光路系统的调整, 而按照库勒(或科拉)照明系统的要求和步骤来进行, 就是关键之所在.
库勒照明系统的简单原理就是：
◇光源发光体上的任意一点发出的光，可以照亮显微镜的视域范围；
◇而光源发光体上每一点发出的光汇集起来就使样品上的每一点都受到整个光源的照明.
这就使得显微镜的视域和样品都获得了非常充份而又均匀的照明.
请参看图1, 这是用来说明库勒照明系统照明光路的原理简图.
⑴. 由光源的灯丝1上任一点发出的光，经灯室上或显微镜底座内的集光-聚光(收集照明光并把它加以会聚的)和反光镜系统、以及光源的视场光阑2, 把已放大而又已会聚了的光源像, 投射于聚光镜的孔径光阑4所在的平面即聚光镜的前焦平面上, 而光源发光体的所有光点汇集起来，便在聚光镜的孔径光阑上形成了发光体的完整像. 从光学系统的原理来看, 就好像把光源的发光体正好摆在聚光镜5下方的前焦平面上.
◇而从聚光镜出射的照明光，就是发光体上所有发光点从各个方位上汇集起来的一束平行光, 它穿越样品使样品上获得充份的照明, 因而从物镜7成像的视域中看不到发光体(灯丝)的像, 也就是不出现灯丝的条纹.
◇这一束平行的照明光束, 实际上包含了光源的灯丝像与孔径光阑的像, 则由物镜7会聚成像于物镜的後焦平面8，这样只要把目镜从目镜筒上拔出来望进目镜筒内，就可以看到这两个像.
⑵. 视场光阑位于显微镜的底座上, 其位置正好是在聚光镜的二倍焦距以外. 聚光镜的托架上通常都设有聚光镜高低位置的调节机构, 调节聚光镜的高低位置就可把视场光阑成像于样品平面上. 在样品调焦清晰的同时也可看到清晰的视场光阑像;
◇视场光阑也位于光源的集光-聚光与反光镜的前方, 照明光必须穿过它再投射于聚光镜上, 在这里它的主要功能只是调控投射到聚光镜的照明光束直径的大小;
◇它不能影响显微镜光学上的任何分辩率，也不影响物镜或聚光镜的数值孔径;
◇但视场光阑要利用聚光镜的调中装置把它调到视域的中央, 而它的大小只能是开大到正好消失在所用某一倍数物镜时的视域边缘上;
◇视场光阑对所观察的成像视域消除眩光的作用较为重要, 而对成像反差的影响则较为次要. 但对本身就是低反差的样品成像时, 用视场光阑来消除过多的照明光却显得特别的重要; (生物秀仪器频道 www.bbioo.com)
[next]
◇如果视场光阑开得太大, 从样品上引起的散射光, 以及从光学表面以某些倾斜角折射的光, 都会造成成像质量的变差
⑶ 聚光镜, 也就是前曾述及的台下聚光镜, 通常是装在托架上并由托架作上下移动而调节聚光镜的高低位置. 值得一提的是聚光镜高低位置的调整, 是获得正确库勒照明的最为关键的步骤. 然而, 遗憾的是往往不少使用人员没有遵守正确的调整步骤而使聚光镜位置失调,而且也没有正确地调节孔径光阑的大小, 这些都是造成成像质量变差的原因, 而显微照相的质量也十分不好！
◇把聚光镜正确调好之后, 从聚光镜出射的照明光连同成像光就会以投射光锥的形式把视域照明并充满物镜的後焦平面；
◇聚光镜孔径光阑的主要功能是调控照明光锥的圆锥角, 从而也调控了聚光镜的数值孔径, 这一概念可以参看以下的图2a至图2c, 图中所显示的是调节聚光镜的孔径光阑, 使它在不同数值孔径所形成的出射光锥：
图2a. 数值孔径约为1.2的聚光镜所形成的光锥较为宽大, 可以和大数值孔径的物镜配合对样品作出照明.
图2b. 数值孔径约为0.6的聚光镜所形成的光锥收窄了一些, 可以和中等数值孔径的物镜配合对样品作出照明.
图2c. 数值孔径约为0.3的聚光镜所形成的光锥更窄了, 只可以和低数值孔径的物镜如10x配合对样品成像.
◇值得注意的是，就聚光镜出射光锥的形状和大小来说，把视场光阑收小只能稍稍减少 (在聚光镜的前端透镜上) 聚光镜出射光锥底部的大小，对光锥圆锥角的大小没有影响！
◇把视场光阑收小, 出射光锥的圆锥角及其数值孔径都基本上保持不变；
◇把视场光阑收小, 出射光锥的圆锥角及其数值孔径都基本上保持不变；还有一个重要的观念，往往为初学使用显微镜的人员或者一些已习惯性使用的熟手所忽略, 那就是成像视野的亮度不应该用开大或收小聚光镜的孔径光阑来操控！或者, 也不应该把聚光镜升高来增加亮度！
[next]
◇顺便多说一下, 成像视野的亮度应该只能使用减光率不同的中性减光滤光片插进照明光路中来调节, 或者调整光源的工作电压来调节; 但对于彩色显微照相来说, 调整电压会引起光源色温的变化, 使彩色出现偏差；(以后有机会介绍显微照相时再对这一方面作较详细的讲解)；
◇关于聚光镜孔径光阑大小的调节, 不应单纯考虑与所需要的物镜数值孔径保持相同, 同时还要考虑所成像的质量问题. 以综合的考虑来说, 聚光镜的孔径光阑应收小到能使成像获得足够的反差, 但又不致于小到要损失分辩率和细节. 通常,孔径光阑的大小收小到等于所用物镜出射光瞳的2/3或4/5就可以了, 这是在最大分辩率与最佳反差间所作的折衷.
(要看到孔径光阑的大小, 可以把显微镜的其中一个目镜从其双目镜筒的座子上拔出, 再把眼睛在离镜筒口约10-20mm处望进去, 就可看到物镜的出射光瞳面上的孔径光阑像, 如图3所示:
下面以显微照相的照片来说明孔径光阑的设定对于成像质量的影响：
八、九十年代期间, 我在全国各地安装、培训显微镜的讲课上, 因为有实在的显微镜可以作上述的演示,并且着重强调了孔径光阑的重要作用; 但讲义上则因当时的微电脑应用技术并未像今天如此完善, 也就没有如此详细的图解.
图3a. 这是一张组织切片, 当聚光镜孔径光阑(左图)开大到与物镜的数值孔径接近时, 虽然存在着相当大量的杂散光和眩光, 但大部分的细节都可见; 只是看起来好像蒙上了一层灰雾. 所以开大孔径光阑的效果不可能是增加视野的亮度, 效果上反而是降低了分辩率并使反差变坏！
图3b. 这是同一张组织切片, 当聚光镜孔径光阑(左图)收小到等于物镜数值孔径的 80% 时, 眩光减少了, 成像亮度有所减弱但细节却显得较为丰富而非常清晰, 成像的细节显现出没有明显的衍射假象; 这是在最大分辩率与最佳反差之间作了最佳的折衷. 作显微照相时就要把孔径光阑严格控制在这一大小上下.
图3c. 这还是同一张组织切片, 当聚光镜孔径光阑(左图)收小到等于物镜数值孔径的 60% 时, 由于衍射假象和折射现象的存在, 使成像细节变得有些不太清晰与阴暗, 所以与原有样品的色调有所偏差.
[next]
以下的步序 1. 至 4c. 是库勒照明系统调整的准备工作; 5. 至 11. 才是正式的调整步序.
在进行库勒照明系统调整之前, 有相当重要的一步前提步骤就是光源发光体的调中, 由于这次是以调整库勒照明系统为主题, 因此只列出光源发光体(灯丝)的对中状况图示, 详情以后另有专文介绍.
图4. 像看孔径光阑的方法一样, 把照明光源前面的毛玻璃移开, 就可以看到光源发光体(灯丝)的像，左上图是未对中前灯丝的位置是偏斜的, 左下图是调整後灯丝的像调到照明光路的中央位置上. 现在的卤钨灯(Halogen Lamp), 标明工作电压为12V 功率为100瓦者, 大多数都可以把工作电压调到并保持10.5V, 则是运用得最好, 其色温约为5,500°K(凯氏温标单位), 如感到视野太亮应采用显微镜附有的中性减光滤光片(只减弱光强不改变彩色和色温)来减弱, 尽量不要去调低工作电压, 作黑白底片的显微照像时要遵守, 尤其是作彩色底片的显微照像时, 还要加上色温转换滤光片, 以获得不失真的彩色显微照片. 光源发光体调中後, 记得在照明光路中加入毛玻璃片, 使灯丝像不会干扰显微观察.
库勒照明系统的调整步骤：
1.接通电源点亮照明光源, 再手持一张薄的白纸片搁在显微镜底座上的照明视场光阑上方,如图1a 所示, 检查
光源是否已点亮并且是从视场光阑上出射. 通常可在白纸上看到一个亮斑. 把照明的视场光阑开到最大, 白纸片上的亮斑也变大到其最大直径. 如图1b所示.
2.选用10x物镜, 载物台上放一块已染色的组织切片样品, 同时把载物台升高到与10x物镜最为接近. 再手持刚才的白纸片, 插入样品与物镜间的空间, 把聚光镜的孔径光阑开到最大, 白纸片上的小亮斑就达到其最大亮度. 如果所使用的聚光镜带有可摆进摆出的前端透镜时, 就必须将它摆进光路中并扣入其固定位置上, 这样做的目的是为了下一步的把聚光镜位置调到适当的高低位置上.
3.初步调整聚光镜位置的高低, 这时可以利用聚光镜高低位置的调节旋钮来调节聚光镜的位置, 如图3所示. 调节时应注意调到其前端透镜离样品底面约1-3mm, 但是千万不要使前端透镜触碰到样品载玻片的底面, 并要小心不要把聚光镜连同前端透镜一起提起, 不小心这样做了, 就会使物台上的弹簧样品夹猛然把样品弹离载物台. 目前较好的显微镜都在聚光镜高低位置行程导轨上装有可调节的止动装置, 可以限定聚光镜所能升到的最高位置.
4a.调节瞳距：这时通过目镜中应已可看到亮光, 有时可能也可看到样品细节未完全对好焦的影像, 如果太亮可用中性减光滤光片把光源亮度减弱, 直至观察起来较为舒适. 接着调节双目镜筒上的摺合桥臂来设定两眼瞳孔间的距离，也就是调节到与观察者两眼的瞳孔距离相配合，如图4a所示. 开始时, 双眼所看到的是两个圆形像, 用左、右手分别抓住目镜筒向上、下调节到合并为一个圆形像就完成了, 而摺合桥臂的调节请参看图4b.
4b.这是双目镜筒上的摺合桥臂, 抓住目镜筒缓缓向上、下掰动, 可以使两眼所看到的显微成像并合成单一的像, 这样调节是要把双目镜筒调节到与观察者两眼的瞳孔间距离相配合. 大部分双目镜筒中轴部位的面上都设有刻度盘, 如图4b所示, 其刻度数值相当于以毫米为单位的瞳间距离, 对中国汉族而言, 大部分人的平均瞳距约为65mm., 使用 人员可以很快地大致设定出目镜的适配瞳距. (生物秀仪器频道 www.bbioo.com)
[next]
4c.瞳距调节完成之后， 如果是不可调焦的目镜就可以转到第5步继续.如果是配有两个可调焦的目镜, 就要调节目镜的接目镜以便与观察者眼睛的屈光度相适配. 这样的目镜通常会在目镜筒外侧表有刻度, 以“0”刻度线为基准, 左侧为“＋”有5条刻度线, 适用于调节老花眼而未佩戴老花镜者的屈光度; 右侧为“－”也有5条刻度线, 适用于调节近视眼而未佩戴近视眼镜者的屈光度. 一般在正常眼的情形下, 把接目镜上的白色标记点对准“0”刻度线, 左右两眼所看到的显微成像都同样清晰, 如图4c所示. (注意！这只是电脑所模拟出来的示意说明图！). 如果是可调焦目镜却又把接目镜置于任意的刻度位置上, 两眼所看到的就是模糊像如图4d所示. (注意！这也同样只是电脑所模拟出来稍微夸张一些的示意说明图！).
以上6个步骤(1－4c)都是为正式作库勒照明系统的调试所做的准备步序, 以下开始作正式调试：
在第2步序中已选用10x物镜, 载物台上放一块已染色的组织切片样品, 同时把载物台升高到与10x物镜最为接近. 现在接着第5.步序,
[next]
5.把样品调焦清 (Set sharpness)：如图5a所示，双眼望进显微镜的视野中, 这时可分别用粗或细调焦旋钮把物台慢慢向下调, 待视野中显现出样品的初步细节时, 就只能改用细调焦旋钮缓缓调节, 使视野中的组织切片像的细节调到最为清晰, 如图5b所示
6.把视场光阑收小, 视野中变暗并出现一个模糊的(多边)亮斑, 这便是视场光阑的模糊像, 它不会正好在视域的中央, 而是偏向视域的某一部位, 如图6 所示为偏向左上方.
7.利用聚光镜的高低位置调节旋钮, 如图7a所示, (由于在第3.步序中已把聚光镜升到可能的最高位置上), 把聚光镜缓缓向下调, 使视场光阑的模糊像逐渐变为清晰的多边形象, 为便于判断, 可把视场光阑稍微开大些, 如图7b所示.
8.调节聚光镜上的调中螺丝 (Centering screws), 如图8a 所示, 把多变形像调向视域中央, 过程与方法如下: 把视
场光阑开大到几乎要充满整个的视域如图8b, 这时看一看光阑像的边缘, 就会看到它的外围留有狭窄而黑暗的环形边缘部份, 这时判断一下多边形的边缘与圆形视域的间距, 如果几乎相等时, 就可视场光阑再稍为开大些.
9.在上一步序中, 把视场光阑再稍为开大些, 目的在于使视场光阑
更接近视域的边缘, 让它成为视域的内接多边形, 以便进一步验证其调中的情形, 如图9所示, 有偏差时, 微微再做些少工夫就可以了.
10.当视场光阑完全调中后, 只要再稍微开大视常光阑, 使多边形像
正好移出视域边缘, 如图10所示. 这就是调中完成後的视域, 成像由中央到边缘的照明亮度很是均匀, 由于视场光阑的大小正好开大到消失在视域边缘上, 视域以外的杂散光都被阻挡掉, 视域中就不会有杂散光的干扰了. 现在几乎已获得了相当好的显微成像, 只是成像的反差还有待于改善.
11.记得调试开始时的第2.步序中, 曾把孔径光阑完全开大, 目的在于让更多的照明光进入视域中, 现在有必要作一些改正以获得较好的反差. 换言之, 孔径光阑不可以收得太小, 否则会降低成像细节的分辩率. 把目镜从其双目镜筒的座子上取出, 如图11a所示, 就可把眼睛在离镜筒口约10-20mm处望进目镜筒内就可看到物镜出射光瞳的像, 定义它的大小为100%, 如图11b所示. 调大调小聚光镜上的孔径光阑直至可在物镜出射光瞳面上确认出它的大小, 最后, 把孔径光阑像的大小调到等于物镜出射光瞳直径的2/3 (66 %) 至 4/5 (80 %), 如图11c所示. 这样调整之后，显微镜的成像也达到了几乎最大的分辩率与最佳的反差. 由于只有最佳反差的成像才能使眼睛感觉到最好, 因此, 通常是要在分辩率上作这样的折衷.
插回目镜并看进显微镜中, 至此, 显微镜已用先前的物镜(即10x) 按库勒照明系统的要求作好了调整. 现在就可以开始想要进行的工作. 然而, 如果换用其它倍率更高的物镜, 千万要记住, 必须重调视场光阑和孔径光阑！例如：换用40x的物镜时, 由于所看到的样品范围小了, 就要把视场光阑收小并检查其调中状况; 同时由于倍数较高的物镜其数值孔径也较大, 所以聚光镜的孔径光阑也要相应开大一些. 总而言之, 每换用一个倍数的物镜, 就要把这两个重要的光阑按前述的步骤重调或检查核对一下.
[next]
值得一提的是, 聚光镜的孔径光阑在显微镜出厂时已做好了对中并作了固定, 所以它是不必另作调中的, 不论在任何一个倍率的物镜下, 聚光镜的孔径光阑和所配用的物镜一定是同轴(或和轴)的.
库勒照明系统调好之后:
◇显微镜的样品和视域就能获得均匀而又充份的照明, 也不会出现眩光，在成像的分辩率与反差之间也能达到最佳的兼顾；
◇光源的视场光阑控制着样品上受照明的区域, 而这一区域就是按照库勒照明系统的要求而调节的视场光阑大
小, 它正好和所观察的视域大小相同, 从而减少了视域以外杂散光对所观察视域的影响, 尤其是可以免除显微照相底片上的灰雾;
◇从聚光镜出射的照明光束直径大小应调到与所用物镜的数值孔径相适配, 即聚光镜的孔径光阑应稍小于物镜的数值孔径, 以获得最佳的分辩率;
◇作显微照相时, 目镜内通常都会装上取景框分划板, 如图12所示, 底片上的取景范围就是这四个直角□□□□所限定的范围(注意！图12中的取景框是以一个与135胶卷幅面相近的矩形框来代替，用以说明显微照相时视场光阑所应收小的范围), 所以要把视场光阑收小到正好与取景框的四个角相接, 就可以把更多的杂散光限制在底片成像的范围以外; 如果不注意这样做, 杂散光太多就会使拍出来的显微照片蒙上一层灰雾，反差变坏！
◇值得提醒的是, 以上所调整出来的库勒照明系统并不适用于低倍率的物镜, 例如5x以下. 要作好低倍率物镜下的显微观察, 首先要用10x物镜把显微镜的的照明光路系统调好, 然后把聚光镜上的旋进摆出式前端透镜摆出光路外, 这时才能和5x、4x、2.5x等物镜配用, 而聚光镜的高低位置则应保持不改变；
◇前端透镜摆出光路外时, 聚光镜的性能就会有根本的改变, 孔径光路不再有调控照明光束数值孔径的功能, 而光源发光体(灯丝)的像不再成像于孔径光阑上. 为避免成像模糊, 聚光镜的孔径光阑应开到最大, 样品成像的反差则由视场光阑所控制, 而照明光束的数值孔径现在也是由视场光阑来控制！
|
显身卡
